Proef 1: DNA isoleren en zuiveren

 

Doel van de proef

 

Het isoleren en zuiveren van plasmide DNA uit bacteriën.

 

Materiaal en methoden

 

Volgens protocol zoals beschreven in het practicum handleiding SI-219 Celbiologie Moleculaire cytologie.

De onbekende marker die we gebruikt hebben is M2

 

Resultaten

 

Marker		Absorptie
	A260	A280	A320
MARCKS-GFP	0,264	0,184	0,024
M2	0,172	0,132	0,015

 

Conclusie

 

Je kunt uit deze proef concluderen dat het DNA dat we geïsoleerd en gezuiverd hebben, deels goed is verlopen. Uit onze metingen is gebleken dat het DNA niet echt zuiver is (zie opdrachten), maar dat zou kunnen liggen aan de materialen die we gebruikt hebben. Bij proef 5 & 6 kunnen we pas echt kijken het DNA goed genoeg was. De concentratie van het MARCKS-GFP is 264 µg/ml en de concentratie van M2 is 172 µg/ml.

 

Opdrachten

 

• SDS (een zeep) lyseert de cellen, omdat het een zeep is die d.m.v. micellen het celmembraan kapot maakt.

Met denaturatie van DNA wordt bedoeld dat de waterstofbruggen worden verbroken door de lage pH.

• De alkalische condities zorgen voor denaturatie van proteïnen en van het chromosomaal en plasmide DNA. Het lysaat wordt geneutraliseerd en aangepast door KAc.

Door de hoge zoutconcentratie zullen gedenatureerde proteïnen en chromosomaal DNA precipiteren, terwijl het kortere plasmide-DNA renatureert en in oplossing blijft.

• NaOH/SDS wordt gebruikt om het lysaat te neutraliseren als het chromosomale DNA renatureert en coaguleerd om het pellet te vormen. Op hetzelfde moment, resulteert hoge concentraties van het NaOH/SDS ook in de precipitatie van het eiwit-SDS complex en het mRNA.

De drie belangrijkst stoffen: het chromosomale DNA, het eiwit-SDS complex en het mRNA wordt verwijdert door het centrifugeren.

• 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Starcodon = CMV

Stopcondon = MARCKS

•  

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

• MARCKS-GFP is een indicator voor de actieve site van PKC. MARCKS-GFP is aanwezig op het plasmamembraan in ongefosforyleerde vorm en wordt vrijgegeven van het membraan door fosforylatie van PKC.

 

 

 

 

 

 

 

 

·        Concentratie en zuiverheid van het MARCKS-GFP:

 

50 µg/ml DNA: A₂₆₀ = 1,0

Zuiver DNA: A₂₆₀/ A₂₈₀ > 1,8 en A₃₂₀ < 0,01

 

A₂₆₀ = 0,264

3

0,264 x 50 = 13,2 µg/ml

 

13,2 x 20 (verdunningsfactor) = 264 µg/ml

 

De concentratie van het MARCKS-GFP is 264 µg/ml

 

Zuiverheid DNA:

 

A₂₆₀/ A₂₈₀ > 1,8  

 

A₂₆₀ = 0,264 en A₂₈₀ = 0,184 en A₃₂₀ = 0,024

 

A₂₆₀/ A₂₈₀ = 0,264/0,184 = 1,4

 

Hieruit blijkt dat ons DNA niet voldoet aan de waarden die gesteld worden aan de zuiverheid van DNA. We hebben hier wel mee doorgewerkt verder in het experiment.

 

Concentratie en zuiverheid van M2:

 

50 µg/ml DNA: A₂₆₀ = 1,0

Zuiver DNA: A₂₆₀/ A₂₈₀ > 1,8 en A₃₂₀ < 0,01

 

A₂₆₀ = 0,172

 

0,172 x 50 = 8,6 µg/ml

 

8,6 x 20 (verdunningsfactor) = 172 µg/ml

 

De concentratie van M2 is 172 µg/ml

 

Zuiverheid DNA:

 

A₂₆₀/ A₂₈₀ > 1,8  

 

A₂₆₀ = 0,172 en A₂₈₀ = 0,132 en A₃₂₀ = 0,015

 

A₂₆₀/ A₂₈₀ = 0,172/0,132 = 1,3

 

 

 

 

NEXT....                                                   PRACTICUM      1. 2. 3. 4. 5. 6.